4 接头
本文成立的白及体外测定凝血酶时间的生物活性测定要领，具有操纵简朴、快速、反复性好，本钱低的特点，切合“中药生物活性测定指导原则”[13]的要求，提高了白及的质量节制程度，而且为止血类中药的生物质量节制提供新的思路。
2 要领
以白及参照物质为参比，凭据上述成立的要领对13批差异产地的白及药材举办比拟检定，并全部通过靠得住性检讨，功效见表3。
3.5.1 仪器紧密度考查 按上述条件，取事情比较品制备成溶液，取同一份白及样品供试液，举办凝血酶时间（TT）测定，反复测定6次，与事情比较品溶液举办比拟检定，计较测得值的变异系数，平均止血生物效价1 004.26 U·g-1，RSD 3.8%。
功效提示，差异产地的白及药材品质存在差别，止血生物效代价为821.93～1 187.53 U·g-1，可信限率为2.35%～9.93%，个中以云、贵、川所产的白及效代价较高，且差别较小（927.25～1 187.53 U·g-1）。
在详细尝试进程中，回收国度药典委员会体例的《中国药典生物检定统计措施BS2000》计较样品的止血生物效代价。
10批白及参照物质的止血生物效价平均值为1 020.94 U·g-1，与参照物质等比殽杂物Bjs05的理论效价根基一致，10批参照物质的RSD为4.6%，表白差异批次间的颠簸相对较小，牢靠产地来历制备的白及参照物质止血生物效价根基不变。
3.3 止血生物效价计较和尝试误差预计
相对付白及参照物质Bjs05，维生素K1的止血生物效价为1 811.80 U·g-1，可信限率（FL）为6.033 9%。
LG-PABER-I血小板聚积凝血因子阐明仪（北京世帝科学仪器公司）；Allegra64R台式冷冻离心机（美国贝克曼公司）；LT5001E电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司）。
以维生素K1为比较物质对白及参照物质（记为Bjs05）的止血生物效价举办标化（Bjs05是10批廉价白及参照物质的等比殽杂物）。而且将Bjs05的止血生物效价界说为1 000 U·g-1。
[要害词]白及；凝血酶时间；止血生物效价；质量节制
3.5 要领学考查
将上面功效换算后，凭据本文的尝试功效，可赋予白及参照物质Bjs05止血生物效价U实际意义，即1 U白及参照物Bjs05的止血浸染相当于0.552 mg维生素K1。通过回收维生素K1标定后，可担保实际事情中比较品止血生物效价的连贯性。
康健SD大鼠，体重280～320 g，雄性，由贵阳医学院动物尝试中心提供，利用许可证号SCXK（黔） 2012-001。
3 功效
本课题组通过前期尝试对凝血4项举办筛查，最终选择凝血酶时间（TT）作为考查指标，并较量了白及差异提取组分的止血活性，个中白及多糖的止血浸染较好，因此回收白及多糖举办止血生物效价的研究，为后续深入阐发白及药效物质基本提供参考，也为完善白及质量节制提供科学依据。
1 质料
3.5.4 不变性考查 别离于0，1，4，8 h将冷藏生存于4 ℃的同一白及供试液按上述条件测定TT，计较平均止血生物效价为954.90 U·g-1，RSD 3.7%，功效表白白及供试品溶液在4 ℃生存条件下8 h内是不变的。
3.1 白及止血活性检测和量效干系考查
2.4 白及止血生物效价测定要领
白及Bletilla striata （Thunb.） Reichb. F.为兰科植物白及的干燥块茎，性温，味苦、甘、辛，具有补肺、止血、散风除湿、通窍止痛、消肿排脓、生肌、敛疮的成果[1-2]。白及作为一种传统的中药，被民间遍及利用。2010年版《中国药典》所收载的白及质量节制尺度中仅有显微辨别、薄层色谱辨别、水分查抄、总灰分等，很难全面的对白及的质量举办评价。
测定廉价的10批白及参照物质止血生物效价颠簸环境，测定要领同2.1.3。
3.5.3 反复性考查 将同一批次样品分6次提取，制成供试品溶液，按上述要领操纵。功效表白，平均止血生物效价967.64 U·g-1，RSD 3.2%，认为该要领具有较好的可反复性。
3.2 靠得住性检讨
[摘要]回收凝血酶时间（TT）将比较物质维生素K1打针液与白及参照物质举办比拟检定，对白及参照物质举办标化，成立了白及体外测定凝血酶时间的生物活性测定要领，运用“量回响平行线法”（3.3）对差异产地的白及举办止血生物效价测定。白及参照物质量效之间具有精采的线性干系（Y=66.332-23.913X，R2=0.995 3），测得差异产地白及止血生物效价为821.93～1 187.53 U·g-1，并均能通过靠得住性检讨（偏离直线P>0.05，偏离平行P>0.05）。该要领仪器紧密度（RSD 3.8%）、中间紧密度（RSD 4.6%）、反复性（RSD 3.2%）、不变性（RSD 3.7%）较好，所成立的白及止血生物效价检测要领靠得住，操纵轻便，反复性好，可用于白及止血生物效价的测定。
2.1.2 大鼠血浆的制备 取SD大鼠，禁食不禁水12 h，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，用一次性专用真空采血管（含3.8%枸橼酸钠）1∶9抗凝，4 ℃ 3 000 r·min-1离心15 min，吸取上清液，制备待测血浆。
[1]李嵘， 王喆之. 白及的研究概述及其资源操作对策[J]. 中草药， 2006， 37（11）：1751.
3.4 10批白及参照物质变异性考查
2.1 凝血酶时间（TT）的测定
[参考文献]
3.5.2 中间紧密度考查 本尝试室2个差异尝试人员在2个差异时间，按上述条件反复测定，计较平均止血生物效价1 013.58 U·g-1，RSD 4.6%。
白及以TT为纵坐标Y，样品质量浓度 （g·L-1）的对数值为横坐标X，经线性回归，回归方程的功效为Y=66.332-23.913X，R2=0.995 3。功效表白，白及溶液质量浓度在15.76～75 g·L-1与凝血酶时间有较好的量效干系，说大白及适合量回响平行线法计较止血生物效价[5]。 预尝试中发明，白及参照物质Bjs05和维生素K1单元质量的活性强度约莫相差1.5～2倍，现取中间值预计维生素K1的止血生物效价为1 750 U·g-1，凭据2010年版《中国药典》（二部）附录ⅩⅣ生物检定统计法项下“量回响平行线法”测定，功效见表1，2。
2.3 差异批次白及参照物质的止血生物效价变异考查
凝血酶时间（TT）测定试剂盒（TT试剂为2 mL/瓶，批号STY20301-39，北京世帝科学仪器公司）；水合氯醛（AR，批号20100331，天津市科密欧化学试剂有限公司）；阳性比较药：维生素K1打针液（批号1307126431，辰欣药业股份有限公司）。
2.5 计较软件
[2]任华忠， 何毓敏， 杨丽. 白及化学身分其药理活性研究希望[J]. 亚太传统医药， 2009， 5（2）：134.
白及样品13批（贵州3批，正安燕岩2批，正安桴焉、四川、云南楚雄、甘肃、安徽、广西河池、江西樟树、关岭县花红镇各1批），经贵阳医学院生药学教研室龙庆德传授判断均为兰科植物白及B. striata （Thunb.） Reichb. F. 的干燥块茎。参照文献[3]，10批生物检定用白及参照物质来历于白及B. striata （Thunb.） Reichb. F ，产地贵州正安县，品级优级。
白及是一种民间常用的止血药，今朝以白及为主药上市的产物有白百抗痨颗粒、百贝益肺胶囊、千山活血膏等20多其中药品种。今朝对其研究主要会合在止血活性、化学身分和含量测定方面。
2.1.1 供试品溶液的制备 取差异产地白及别离以8倍、6倍、6倍量水煎煮，每次1 h，归并滤液，浓缩（药材质量与药液体积比为1∶5），加95%乙醇至含醇量为70%，搅匀，安排留宿，过滤，滤渣挥去乙醇，真空减压干燥（60 ℃），毁坏成粉（平均得率14.6%），混匀，生存于干燥阴凉处。取适量粉末，用蒸馏水溶解，配制成生药浓度60 g·L-1的溶液，临用时按1∶0.8倍剂距等比稀释成必然浓度的供试品溶液。白及参照物质按上述要领制成事情比较品溶液。
试品间差别无显著性，说明供试品与比较品止血生物效价无明明不同；回归项的差别很是显著（P<0.01），说明跟着剂量的增加TT有纪律的低落；同时剂间差别很是显著（P<0.01），说明试验剂量比例和试验布置公道。偏离平行的差别无显著性，而二次曲线和反向二次曲线差别均不显著，说明S和T量效线性精采，且呈平行直线干系，通过靠得住性检讨，比拟检定所获得的止血生物效价功效精确可信，可用“量回响平行法”检测供试品的止血生物效价[3]。
测定TT时，室温离心制备的血浆在室温安排2 h与立刻测定的功效差别具有统计学意义（P<0.01），跟着时间的耽误血浆的不变性下降，而低温（4 ℃）离心的血浆在8 h内检测所测得的止血生物效代价是不变的，功效提示，所制备的血浆应实时检测，安排时间最长不高出8 h。
2.1.3 TT的测定 取一次性血凝仪测试杯，每通道插手血浆100 μL，和相应的样品溶液50 μL，磁珠搅拌混匀，精确预温180 s，插手TT试剂100 μL，用LG-PABER-I血小板聚积凝血因子阐明仪测定每个通道的凝血酶时间。
当血管产生损伤时，血液在成果上存在凝血和抗凝2个进程，两者对立统一，相辅相成，以维持血液的动态均衡。个中凝血4项常用于研究止血药[6]或活血药[7]对凝血系统的影响。
在成立生物活性测定法中最要害的就是参照物的选择与标化，本尝试选择临床应用遍及的维生素K1打针液对白及参照物质举办标化，以确保在实际应用中事情参照物质的可溯源性和可延续性。
将所设置的白及参照物质Bjs05和样品溶液按1∶0.8剂间距稀释，以白及参照物质Bjs05为事情比较组（S），差异产地白及样品溶液为供试品组（T），按2.1项下要领别离测定事情比较组和供试品组含药血浆的TT，平行测定6次。凭据《中国药典》2010年版二部附录ⅩⅣ生物检定统计法项下“量回响平行线法”[4]举办统计学处理惩罚，计较差异产地白及止血生物效价（PT）和可信限率（FL）。
3.6 差异产地白及样品的止血生物效价测定
2.2 白及参照物质原始效价赋值与标定
近几年，将生物检定法用于中药质量节制已成为研究的热点[3]。生物检定法从整体的角度出发，能量化生物效应，反应中药在临床应用中的量效干系，出格合用于药效物质基本不清楚而药效明晰的药物。本尝试成立了基于凝血酶时间测定的白及生物活性测定法，为完善其现行的质量节制尺度，以及其临床用药的安详性、有效性提供保障。
白及干燥块茎的主要身分为白及多糖（白及胶），化学身分主要包罗联苄类、菲类及其衍生物、白及甘露聚糖、淀粉等[8-10]。文献报道白及多糖具有止血敛创、抗菌消炎的功能，而且其可以或许促进血小板聚积，加快凝血进程，临床常将其用于治疗表里伤出血[11-12]。
