碱性蛋白表面印迹材料的制备及其大分子识别特
毕业论文库：博士论文 时间：2017-01-24 点击：
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碱性蛋白质(等电点pI>7)是组织蛋白及细胞蛋白中的重要组成部分,在生命体中发挥着重要的生物功能,在生物医药学领域具有重要的研究与应用价值。从生物组织中分离提取或采用基因工程进行重组合成然后再进行分离纯化是获得碱性蛋白质的两种主要途径,但无论采用哪种方法,都急需发展新的分离纯化技术和分离材料。在各种分离纯化材料中,分子印迹聚合物(molecular imprinting polymer,MIPs)是迄今为止选择识别性最好的分离介质。目前,以分子印迹聚合物(MIPs)为固体吸附剂的分子印迹固相萃取(Molecularly imprinted solid-phase extraction,MIPSE)技术,广泛应用于各种小分子物质的高效分离与纯化领域,在生物大分子的分离与纯化方面,具有潜在的应用前景。但是,蛋白质分子印迹面临诸多困难,碱性蛋白大分子表面印迹材料鲜见报道。本研究通过分子设计,以胰蛋白酶(TRY)和木瓜蛋白酶(Papain)两种碱性蛋白质为模型蛋白,以对苯乙烯磺酸钠(SSS)和甲基丙烯酸(MAA)为两种功能单体,以交联聚乙烯醇微球(CPVA)为基质,采用“接枝聚合和表面印迹同步进行”的新型表面印迹技术,首次在水介质中成功地制备了高性能碱性蛋白分子表面印迹材料,并深入研究了印迹材料对于模板蛋白大分子的识别特性和识别机理。本文的研究结果在生物大分子的表面印迹技术与理论方面都具有明显的创新性,而且为采用MIPSE技术高效分离纯化碱性蛋白质提供了高性能表面印迹材料,在生物大分子的分离纯化及其他相关的生化领域有着重要的科学价值。首先,采用紫外光谱法和荧光光谱法,分别考察研究了单体SSS和MAA与碱性蛋白TRY及Papain之间的相互作用,实验结果表明,在水介质中两种阴离子性单体和两种碱性蛋白之间存在着强烈的静电相互作用,会自动形成主-客体复合物,这就为实施TRY及Papain的表面印迹奠定了充分的理论基础。使甲基丙烯酰氯与CPVA微球表面羟基之间发生酯化反应,将大量可聚合双键甲基丙烯酰基(MAO)引入微球表面,获得改性微球MAO-CPVA;在水溶液中,由过硫酸盐引发体系所产生的自由基使包围在TRY周围的单体SSS及交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)与微球MAO-CPVA表面的双键发生聚合反应,即产生接枝交联聚合(属“graftingthrough”接枝法),而模板try则被包裹在交联网络之中,从而实现了sss的接枝聚合和try表面印迹的同步进行;除去模板后便得到了try表面印迹微球mip-psss/cpva。采用红外光谱(ir)和扫描电子显微镜(sem)对产物微球进行了表征。通过静态结合与竞争结合实验,深入考察了表面印迹微球的大分子识别性能与识别机理,并考察研究了主要因素对表面印迹微识别选择性的影响。研究结果表明,表面印迹微球mip-psss/cpva对模板try具有优良的结合亲和性和特异的识别选择性,结合容量高达85.9mg/g,相对于对比蛋白溶菌酶(lzm,也是一种碱性蛋白),印迹微球mip-psss/cpva对try的选择性系数高达17.52;影响try印迹微球识别性能的主要因素为单体sss与模板try以及单体sss与交联剂mba的物质量之比,适宜的质量之比分别600:1和35:1;另外,try印迹微球具有良好的解吸性能(解吸率为98.46%)与重复使用性能。接着,以maa为功能单体,采用与上述相同的实验步骤,也实施了try大分子的表面印迹,制得了印迹微球mip-pmaa/cpva,以木瓜蛋白酶(papain)为参比蛋白,也探究了表面印迹微球的大分子识别性能。研究结果表明,表面印迹微球mip-pmaa/cpva对try也具有优良的结合亲和性与特异的识别选择性,结合容量高达84.0mg/g,相对于对比蛋白papain,对try的选择性系数高达21.62。单体maa与模板try以及单体maa与交联剂mba之间适宜的物质量之比分别为500:1和35:1。本研究又以木瓜蛋白酶papain为模板蛋白,制备了另一类碱性蛋白表面印迹微球。使氯乙胺与cpva微球表面的羟基发生亲核取代反应,从而将大量的乙氨基(ea)引入微球的表面,制得改性微球ea-cpva;改性微球ea-cpva表面的氨基与溶液中的过硫酸盐构成表面氧化-还原体系,在cpva微球表面产生大量的自由基;这些自由基使包围在papain周围的单体sss与交联剂mba发生接枝交联聚合(属“graftingfrom”法),而papain大分子则被包裹于交联网络中,从而实现了sss的接枝聚合和papain表面印迹的同步进行;除去模板后便得到了papain表面印迹微球mip-psss/cpva。在对印迹微球进行充分表征的基础上,重点考察了印迹微球大分子识别性能与识别机理。实验结果表明,印迹微球mip-psss/cpva对模板蛋白大分子papain具有良好的结合亲和性和识别选择性,结合容量为44.9mg/g,相对于对比蛋白try,对papain的选择性系数为14.35。单体sss与模板papain以及单体sss与交联剂mba之间适宜的物质量之比分别为750:1和45:1。印迹微球MIP-PSSS/CPVA也具有良好的洗脱性能(解吸率为98.17%)与重复使用性能。接着,同样也以MAA为功能单体,采用上述的表面引发接枝聚合法,在改性微球EA-CPVA表面实施了Papain大分子的表面印迹,制得了印迹微球MIP-PMAA/CPVA,该印迹微球对Papain也具有良好的结合亲和性和识别选择性,结合容量为46.3 mg/g,相对于对比蛋白TRY,对Papain的选择性系数为17.4。单体MAA与模板Papain以及单体MAA与交联剂MBA之间适宜的物质量之比分别为600:1和40:1。最后,本研究还制备了阴离子聚电解质接枝刷CPVA-g-PSSS,考察研究了该接枝刷对胰蛋白酶TRY和溶菌酶LZM两种碱性蛋白质的吸附性能,研究了吸附机理与吸附热力学。研究结果表明,在水介质中,凭借强烈的静电相互作用,该接枝刷对两碱性蛋白都具有很强的吸附作用。聚电解质接枝刷是蛋白质的一种性能优异的吸附材料,蛋白质大分子嵌入充分伸展的聚电解质刷链之间,既不影响蛋白质的空间结构与构象,还能导致很高的吸附容量。介质的pH值对吸附容量有很大的影响,随着介质pH值的增大,TRY和LZM的吸附容量均呈现先增大后减小的变化趋势,当pH值等于它们的等电点时,具有最高的吸附容量(TRY,82mg/g;LZM,78mg/g)。吸附过程熵值增大且放出热量,是熵驱动的吸附过程。
