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摘要：大范围骨缺损通常由外伤、畸形和骨肿瘤等致病因素导致。自体骨移植和异体骨移植是临床上治疗骨缺损的常用方法,然而,由于骨移植物来源有限、供骨区并发症、感染、排斥反应等原因,其应用受到限制。在骨组织工程领域,已经有很多骨组织工程支架制备出来,但这些支架材料还未能进入临床应用,主要是因为目前的材料构建方案还不能达到骨组织工程的金标准。因此,制备一种可以在生物层面和结构层面模拟天然骨基质的生物材料是十分必要的。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cememt, CPC)复合材料是一种新型自固化人工骨替代材料,它是由磷酸盐粉末与生理盐水等液体,按照一定比例混合后制备而来。在植入人体内后,磷酸钙骨水泥可被生理性降解,其降解的终产物是羟基磷灰石(HA)结晶。目前,CPC凭借其良好的生物相容性、骨传导性、可塑形性及聚合不放热等优点而获得青睐,成为骨外科应用广泛的骨填充材料之一。另外,磷酸钙骨水泥材料还可以作为生长因子的载体,它可以与抗生素、药物、生长因子复合,在局部实现其特定的生物效果,已有的动物实验证实磷酸钙骨水泥材料能够产生良好的组织反应。因此,磷酸钙骨水泥材料是一种极具应用前景的骨水泥生物骨修复材料。将生物活性大分子和支架结合似乎是一种较好的骨修复策略,其中一种骨组织工程策略就是应用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)来获得材料的骨诱导性,促进极量骨缺损的修复。1982年,Urist首次在牛骨中提取出活性骨形态发生蛋白(BMP)。骨形态发生蛋白-2(BMP-2)是目前唯一能单独诱导异位成骨和单独促进骨缺损愈合修复的骨分化生长因子,其中BMP-2诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向定向分化的能力最强。天然骨中含有的BMP-2量很有限,但研究人员已经通过基因工程技术解决了这一问题,制备出重组人骨形态发生蛋白-2 (rhBMP-2)。目前,重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)应用缺陷包括：制备工艺复杂、多重生物学效应、生物学活性低、半衰期短、缺乏亲骨性等。研究发现,在天然人BMP-2成熟肽的114个氨基酸中,核心结构域是由5-20个氨基酸组成的,是真正发挥骨诱导作用结构。P24多肽来源于BMP-2的“指节簇”,可极大地发挥BMP-2的生物学作用。P24与BMP-2不仅仅是肽链长短之别,独特的优势表现诸多方面在：1)大规模合成；2)线性结构,活性位点更能充分暴露,生物学活性高,稳定性好；3)作用专一,副作用小；4)免疫原性低；5)无破骨活化作用；6)易于表面修饰。P24多肽已被证实能够调控骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖和分化,诱导体内异位成骨。除此之外,P24多肽含有天门冬氨酸和磷酸化的丝氨酸,它们可以形成酸性环境,促进钙磷离子沉积,加速晶核形成与矿化过程。将具有成骨诱导活性的生长因子与性能良好的载体支架材料复合可以达到良好的控释效果。目前构建因子控释材料的方法主要有两种,一种是化学交联法,另一种是物理吸附法。化学交联法是指在将支架材料与活性因子以化学共价键结合,通常需要在材料加工过程中添加活性因子,使之在材料中均匀分布,实现缓释目的；但是,由于在支架制备的过程需要使用多种有机溶剂,活性因子难免会直接接触到有机溶剂,大大削弱其生物学活性；物理吸附法则完全不同,它是指将已经制备好的支架与因子一起浸泡在液体中,一段时间以后,活性因子便吸附于材料表面或者浸入材料内部,从而达到载药的目的,这种方法的处理过程较化学交联法简单,能够最大程度地保留因子的生物活性,但其缺点也比较明显,即因子在支架材料内的分布可能不够均匀,因子释放速度往往较快,不能最大限度的发挥其正常生物学功能。在众多的组织工程支架材料之中,微球是一种良好的三维支架材料,将其植入到损伤的组织处,例如,骨缺损部位,能够支持细胞扩增和细胞分化,从而修复组织损伤。微球材料还能用来作为细胞的载体,提升细胞的粘附、增殖、迁移性能,从而极大地促进骨缺损修复。许多球状生物材料,如磷酸钙生物材料,都含有活性陶瓷微粒,这些活性物能够影响其体内的骨形成性能；另外,球状形貌对于提高材料的载生物活性因子和细胞性能十分重要。目前,已经有很多研究显示多孔或空心的磷酸钙微球是一种有效的药物递送系统和骨缺损填充物。目的：将P24多肽与磷酸钙骨水泥微球复合,制备出新型载P24多肽的磷酸钙骨水泥微球支架材料,研究该微球材料的因子释放特点,体外细胞相容性、体外成骨诱导性能、体内生物相容性和骨修复性能,旨在根据骨组织工程的应用策略,寻找合适的生物活性因子,促进骨组织工程骨填充复合材料的发展,为进一步的临床应用提供理论借鉴。方法：本研究采用四钙磷酸盐和无水磷酸氢钙制备磷酸钙骨水泥,使用的P24多肽来源于骨形态发生蛋白-2,其多肽序列为(N→C:KIPKA SSVPT ELSAI STLYL SGGC).首先将P24溶解于盐酸溶液(0.1 M)中,加入磷酸钙粉末并持续搅拌直至混合均匀,采用液滴冷凝法制备出微球,再将微球置入微型球形模具中,采用冷冻干燥法进行干燥处理(-50℃,20 Pa)即得到P24/CPC微球。采用此法制备不同P24含量的磷酸钙骨水泥微球支架材料(P24/CPC质量比为0%、2%和4%)--CPC、2% P24/CPC和4% P24/CPC,用于后续的体内体外研究。在体外,采用高性能液相色谱系统检测P24/CPC微球的P24多肽释放性能。将大鼠骨髓间充质干细胞接种于CPC、2% P24/CPC及4% P24/CPC微球支架材料上,置于DMEM培养基中(15%胎牛血清,1%青链霉素混合液)共培养,分别被采用扫描电镜、CCK-8法及DAPI荧光标记法检测细胞形态及增殖情况；采用qPCR检测大鼠骨髓间充质干细胞中的成骨特异性基因(OCN和Runx2)的表达情况；检测大鼠骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶活性。动物实验包括大鼠异位成骨实验和兔股骨缺损骨修复实验两部分。首先,18只健康雌性SD大鼠(平均重量150 g,购于广东省动物实验中心), 随机分成A、B、C三组,每组6只,按照分组分别将CPC、2% P24/CPC及4% P24/CPC微球支架材料植入到大鼠背部竖脊肌肌袋内,术后4周、8周行电子计算机断层扫描(CT), 苏木质伊红染色(H&E染色)以及曼森染色检测。最后,制备新西兰大白兔股骨髁圆柱形股缺损模型,将CPC、2% P24/CPC及4% P24/CPC微球支架材料植入到骨缺损处,术后4周、8周、12周取股骨标本,行电子计算机断层扫描(CT)和组织学检测,评估P24/CPC微球材料的骨修复性能。本研究所得的数据均为计量资料,所有数据采用均数±标准差(x±SD)的形式来表示,在数据整理后,采用SPSS20.0软件进行数据分析。统计学分析选用析因分析或重复测量的方差分析进行统计处理,根据方差齐性检验(Levene’s检验)结果选择校正或不校正的F值和P值。对多因素数据中的某因素组间进行比较,两组之间的比较采用t检验,多组之间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)及LSD多重比较,以P<0.05认为差异有统计学意义。结果：体外实验表明P24/CPC微球能够保持P24多肽活性,并且持续释放P24多肽超过39天。与对照组相比较,不同P24含量的磷酸钙骨水泥微球(P24/CPC质量比为2%和4%)能够较好地支持大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的生长、增殖及材料表面粘附,增加细胞的碱性磷酸酶活性及提高成骨特异性基因(OCN和Runx2)的表达(P<0.05)。体外实验证实P24/CPC微球材料具备良好的细胞相容性,可以显著促进BMSCs的成骨分化。异位成骨实验中,CT结果提示,在术后4周,4%P24/CPC微球材料组大鼠背部组织标本的骨密度显著高于其他组(P<0.05)；术后8周,A、B、C三组的大鼠背部组织标本骨密度(BMD)值均有显著提高(P<0.05)；组织学检测表明,CPC、2% P24/CPC及4% P24/CPC微球支架材料体内降解性能良好,术后4周、8周三组微球材料内部均有血管长入,体内炎症反应轻微,P24/CPC微球支架材料异位成骨程度显著高于单纯CPC微球支架材料。最后,兔股骨骨缺损修复实验中,CT结果表明术后4周、8周、12周,材料组的骨量(BV)及骨密度(BMD)均高于空白组.(P<0.05),4% P24/CPC组的骨量(BV)及骨密度(BMD)高于CPC组(P<0.05),术后12周CPC、2% P24/CPC及4% P24/CPC组股骨缺损基本修复,组织学检测结果提示CPC及P24/CPC微球降解性能良好,置入部位炎症反应轻微,材料组骨缺损修复结果满意,其中P24/CPC微球材料骨修复性能最佳。结论：磷酸钙骨水泥微球是P24多肽的一种良好载体,磷酸钙骨水泥微球与P24多肽复合后可保持多肽的活性,并持续释放P24多肽超过39天。P24多肽无明显的细胞毒性,有助于提升磷酸钙骨水泥微球的成骨性能,是具有良好生物活性的骨组织工程细胞因子。P24/CPC微球支架材料具有良好的生物相容性,生物降解性和骨诱导性,能够促进骨髓间充质干细胞体外成骨分化,促进体内成骨再生,加速体内骨修复过程,是一种较有潜力的骨组织工程支架材料。 还原

关键词：BMP-2多肽; 磷酸钙骨水泥; 微球; 成骨; 骨再生;

导师：于博;